Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline.

Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline.  
Robert M Vodegel et al. 
BMC Dermatol. 2004; 4: 10.

Os autores inadvertidamente deixaram uma biópsia em solução salina durante à noite e perceberam uma melhora na relação sinal-fundo (signal-to-noise ratio) na reação de imunofluorescência direta (IFD) em um caso de dermatose bolhosa. A IFD, a rigor, deve ser mantida em solução salina resfriada apenas em casos em que o transporte se fará rapidamente ao laboratório de plantão para receber as amostras (questões de horas). Diante da inesperada melhora no padrão da reação conseguida com esse descuido, os autores realizaram o trabalho testando a alocação de biópsias perilesionais de lesões bolhosas em solução salina (SS) por 24h e 48h, Meio de Michel (MM) por 24h e 48h e o congelamento imediato em nitrogênio líquido. A SS por 24h foi a que apresentou a maior sensibilidade na detecção de imunodepósitos nas dermatoses bolhosas testadas e os autores recomendam a prévia incubação overnight nesse tempo antes mesmo da fixação com o MM ou o congelamento.

Vinte e cinco pacientes sabidamente portadores de doenças que cursam com imunodepósitos (ID) detectáveis à IFD foram estudados, a biopsia prévia para estudo da IFD fora imediatamente congelada em nitrogênio líquido para corte-congelação. Quatro novas biópsias da área peri-leisional foram feitas e depositadas em meios de transporte diferentes: (a) nitrogênio líquido; (b) Meio de Michel por 48h; (c) solução salina por 24h; (d) solução salina por 48h.

Como resultado os pesquisadores perceberam que o (a) material transportado em solução salina foi tecnicamente mais simples de ser cortado ao criostato se comparado ao material transportado em meio de Michel. (b) As biopsias mantidas em solução salina por 24h mostraram menor fluorescência inespecífica da derme, principalmente com relação ao IgG. Aquelas mantidas por 48h mostraram perda do sinal tanto inespecífico quanto o específico e tenderam a negativar aquelas com baixo-sinal. Aquelas que possuíam sinal alto de positividade (+++/3+) mantiveram-se positivas em todos os meios/tempos de permanência. (c) Houve tendência à formação de clivagem artificial (split) no material mantido em salina, principalmente naqueles com 48h. Outras alterações relacionadas à autólise não foram identificadas. O Split artificial foi inclusive proveitoso tanto para o diagnóstico diferencial entre Penfigóide Bolhoso e Epidermólise Bolhosa Adquirida quanto para aumento do sinal da reação uma vez que a bolha formada artificialmente promoveu um fundo escuro. (d) Um caso de Penfigóide de Membrana Mucosa, originalmente fraco para IgG (+) e IgA (+) ficou óbvio na solução salina (tanto 24h quanto 48h) e resultou negativo nos outros meios de transporte.

Diante desses dados os autores concluíram que o transporte em solução salina por 24h é o que mais apresentou positividade para imunodiagnóstico em dermatopatias bolhosas se comparado ao congelamento imediato e à fixação no Meio de Michel. Esses resultados são corroborados por outros autores como Judd e Lever (1) que mostraram o efeito positivo de aumento da sensibilidade da IFD com o armazenamento em solução salina (24h em solução salina 1.5M + tampão fosfato) antes do congelamento. Atribu-se à melhor percepção dos anticorpos por um melhor contraste, uma vez que a diminuição do background realça os ID específicos. Há quem também atribua tal aumento da sensibilidade a uma maior exposição dos epitopos antigênicos. 

Uma desvantagem da solução salina é (a) seu tempo limitado de armazenamento (até 24h) para se conseguir resultados favoráveis. (b) A segunda desvantagem é devido a uma perda parcial de alguns ANA epidérmicos, possivelmente devido à extraçãoo ou degradaçãoo de alguns antígenos nucleares. (3) Há desvantagem também do ponto de vista da preservação das estruturas à histologia dada às alterações de degeneração hidrópica e clivagem da JDE, fenômens que não ocorrem com o transporte no meio de Michel. Por isso não se prescreve salina no caso de estudos de mapeamento de doenças genéticas e para microscopia eletrônica. Para o estudo de dermatoses bolhosas não é a morfologia ideal que conta, mas o sucesso em se detectar baixos limiares de ID, por isso o uso de SS24h é recomendado pelos autores nesses casos. A Solução Salina pode ser usada como meio padrão, em temperatura ambiente, em casos de transporte postal de biópsias para estudo de IF, se a entrega ao laboratório é garantida em até 24 horas. Outra alternativa é manter a biópsia em SS por 24h e depois fixá-la em meio de Michel para transporte. Caso a biópsia chegue imediatamente depois da coleta ao laboratório, os autores recomendam a incubação overnight em SS antes do congelamento para os cortes, para redução da auto-fluorescência dérmica e otimização dos resultados. 

Artigos citados: Judd KP, Lever WF: Correlation of antibodies in skin and serum with disease severity in pemphigus. Arch Dermatol 1979, 115:428-432.