Clinicopathological evaluation of in vivo epidermal nuclear fluorescence.

Clinicopathological evaluation of in vivo epidermal nuclear fluorescence.

J. X. Sousa Jr, D. Miyamoto, J. M. Zimbres, D. V. Costa and V. Aoki 
Clinical and Experimental Dermatology, 34, 314–318

INTRODUÇÃO: Os autores pretendem estudar o significado clínico da fluorescência nuclear em ceratinócitos. O critério de inclusão foram casos que mostraram positividade para a IFD (auto-anticorpos IgM, IgG, IgA) ou complemento (C3) ligados ao núcleo dos ceratinócitos.

Os autores concluíram que a presença de fatores anti-nucleares in vivo (ANAs) mostraram-se instrumentos interessantes para o diagnóstico das doenças do tecido conjuntivo (CTD), dado que, em 21 de 28 pacientes, o diagnóstico de CTD sistêmica foi confirmado, o que levou os autores a considerar que o VPP para CTD nesse estudo foi de 75%. A IFD em núcleos da epiderme é um fenômeno in vivo que pode preceder o apareceimento de doença do colágeno ou outras doenças inflamatórias/autoimunes. É útil como método complementar no diagnóstico de CTDs se correlacionada a outros achados clínicos, laboratoriais e de evolução da doença.

COMENTÁRIOS SOBRE O TRABALHO: A fluorescência nuclear em epidérmica nas reações de IFD eram consideradas um fenômeno in vitro geralmente relacionado a artefatos técnicos. No entanto, posteriormente, foram conseguidas evidências dessa ocorrência in vivo. m(1, 2) Portanto, a hipótese prévia que os ANA são fenômenos in vitro fora abandonada após a demonstração da internalização dos anticorpos pelas células vivas. (4, 5) Um mecanismo possível para explicar como os autoanticorpos penetram nos ceratinócitos é o “Fc-receptor-mediated endocytosis”. Outra hipótese seria a ligação dos auto-anticorpos a antígenos da superfíce dos auto-anticorpos com sua posterior internalização. Os achados dos presente trabalho corroboram o de outros pesquisadores (4.10.11.15) que sugerem que os auto-anticorpos.

A prevalência dos ANA in vivo varia muito conforme o foco da doença mas é frequentemente encontrada no Lupus Eritematoso Sistêmico (SLE), na doença mista do colágeno (MCTD) e na esclerose sistêmica (SS).

Usando a IFD, o ANA in vivo, principalmente com o IgG, podem ser detectados em condições auto-imunes, em pacientes assintomáticos ou com lesões. (7) O presente trabalho mostrou 3.2% de ocorrência desse fenômeno que está dentro do que se espera na literatura atula (1-10%).

RESULTADOS: De 869 espécimes com suspeita de CTD, 28 mostraram IFD+ nos núcleos dos ceratinócitos da epiderme e forma incluídos no estudo. Anticorpos antinucleares epidérmicos (ANA epidérmicos) do tipo IgG foram detectados em 26 de 28 casos. Destes 28 casos, 22 apresentaram ID apenas de IgG. Os demais 4 casos mostram associações do tipo IgA + C3; IgM apenas; IgA + IgM; e C3 sozinho. Em dois de 28 pacientes, a IF nuclear foi de IgA ou C3. 15 dos 28 paciente exibiram ID nucleares na zona da membrana basal (BMZ), sendo a IgM a mais encontrada nesses casos (12 de 15). DESTES 15, 7 exibiram um padrão misto (IgM, IgA, C3 e/ou IgG). Dos 15 pacientes com anticorpos anti-nucleares associados a depoósitos na BMZ. As doenças que se relacionaram com o ANA in vivo for a SLE (n=9); MCDT (n=3); Síndromes com superposição “overlap syndrome” (n = 3) e vasculites com sorologia anormal (n=3). Oa achados cutaneous associados aos ID de ANA in vivo são patches eritematoescamosas. Púrpura e petéquia, lesões urticariformes e bolhas. O ANA sérico foi positivo em 20 pacientes com títulos de 1:160 a 1:1280. Três pacientes que foram negativos para ANA sérico depois se positivaram em análises subsequentes.

REFERÊNCIAS CITADAS NO TRABALHO:

(1) Izuno GT. Observations on the in vivo reaction of anti- nuclear antibodies with epidermal cells. Br J Dermatol 1978; 4: 391–8. (2) Alarcon-Segovia D. Eppur penetra – proceedings of the second international conference on the penetration of autoantibodies into living cells (Part II). J Autoimmun 1998; 11: 509–10.  (3) Rodrigues CJ, Oliveira RM, Taniwaki NN et al. Epidermal nuclear immunoglobulin deposition in connective tissue diseases. Rev Hosp Clin Fac Med São Paulo 1990; 45: 154–7. (4) Alarcon-Segovia D, Ruiz-Arguelles A, Fishbein E. Antibody to nuclear ribonucleoprotein penetrates live mononuclear cells through Fc receptors. Nature 1978; 271: 67–9. (5) Alarcon-Segovia D, Ruiz-Arguelles A, LLorente L. Broken dogma. Penetration of autoantibodies into living cells. Immunol Today 1996; 17: 163–4.

U-serrated immunodeposition pattern differentiates type VII collagen targeting bullous diseases from other subepidermal bullous autoimmune diseases

U-serrated immunodeposition pattern differentiates type VII collagen 
targeting bullous diseases from other subepidermal bullous autoimmune diseases 
R. M. Vodegel et al. British Journal of Dermatology 2004; 151: 112–118.

Os autores pretendem indicar uma alternativa baseada na morfologia dos imunodepósitos detectados na Epidermólise Bolhosa Adquirida (EAB) para diagnóstico diferencial com outras entidades que cursam com clivagem subepidérmica e imunodepósitos (ID) lineares. A alternativa para tanto, normalmente, é o mapeamento da topografia dos depósitos depois do Split Skin. No entanto, como os ID lineares podem apresentar uma morfologia serreada em “N” ou em “U”, os autores estudaram a possibilidade dessa propriedade morfológica ser de utilidade.

Em resumo, a detecção do padrão "U" separa a EBA e o SLE-B das demais dermatoses com ID lineares subepidérmicos com grande importância no disgnóstico diferencial entre EBA e o PB anti-epiligrina (que, ao contrário do PB, não pode ser separado da EBA pelo Split Skin).

São caracterizados por ID lineares subepidérmicos: (1) Penfigóide Bolhoso, (2) Penfigóide Gestacional, (3) Penfigóide de Membranas Mucosas, (4) Penfigóide p200, (5) Doença IgA Linear e a (6) EBA. No entanto, apenas a EBA apresenta um padrão dito “u-serreado” desses ID lineares ao longo da MB. As demais entidades exibem um padrão dito “n-serreado”. 

Os autores estudaram 157 pacientes com dermatopatia bolhosa de clivagem subdérmica. Todos mostraram ID lineares. A análise mais detalhada da imagem capturada revelou dois padrões distintos, um linear e outro linear/serreado. O primeiro, ainda, quase sempre vinha acompanhado de áreas n- ou u-serreadas mas os dois padrões de serreamento não foram detectados conjuntamente na mesma amostra. Nas 130 biópsias em que o padrão n-serreado foi detectado, estava relacionado aos diagnósticos de BP, MMP, LAD, AECP ou Penfigóide p200. Nas 27 biópsias que o padrão em U foi detectado, exclusivamente estava associado ao diagnóstico de EBA ou Lupus Bolhoso (SLE B). De importância especial foi a observação que todos os casos de Penfigóide Bolhoso anti-epiligrina (AEPB) foram de padrão n-serreado, enquanto os casos de EBA foram todos de padrão u-serreado. De importância especial porque tanto AEPB e EBA mostram ID no lado dérmico da bolha com o Split-Skin, ou seja, o padrão morfológico do ID (se n ou u) é mais útil para o DD nestes casos do que o mapeamento pelo Split-Skin. 

Do ponto de vista ultra-estrutural, a ligação dos auto-anticorpos contra o colágeno VII em casos de EBA se faz estendendo-se apicalmente em torno dos “rootlets” dos ceratinócitos basais. Em contraste, os ID das outras doenças seguem o hemidesmossomo. O padrão N corresponde à ligação dos auto-antígenos acima da região da sub-lâmina densa. Quando as radículas estão ausentes nas células basais, há como resultante, ID mais ou menos lineares realmente. 

Para que se obtenha sucesso no reconhecimento e obtenção das imagens serreadas, é necessário biopsias perilesionais não ulceradas e virgens de tratamento com corticosteroides tópicos; bons cortes (4 micrômetros ou menos); bom sistema de captura de imagens (as imagens analisadas para esse fim serão aquelas digitalizadas. Importante lembrar que os padrões serreados não são observados em mucosas mas, a biópsia perilesional da pele em pacientes que exclusivamente apresentam lesões de mucosas podem ser úteis para detec’ão dos padrões serreados e diagnóstico diferencial.

Portanto, com relação aos ID lineares subepidérmicos, a detecção de um padrão em U pode separar a EBA e o SLE-B das demais dermatoses (BP, PG, MMP, p200-P, AECP). A separação da EBA do AECP pode ser especialmente útil uma vez que não é possível com a metodologia do split skin.

Modelo de Laudo (Biópsia de Pele)

Can direct immunofluorescence testing still be accurate if performed on biopsy specimens after brief inadvertent immersion in formalin?

Can direct immunofluorescence testing still be accurate if performed 

on biopsy specimens after brief inadvertent immersion in formalin? 

Joshua Arbesman et al. 

J Am Acad Dermatol 2011; 65:106-11.

O Formol é o fixador padrão para estudo histológico mas não deve ser usado em biópsias de pele que serão remetidas a exame de imunofluorescência (IF). O Meio de Michel (MM) é o meio de transporte padrão utilizado. No entanto, muitas vezes pode haver acidentes e, inadvertidamente, alocação da biópsia para IF em formol e não no MM.

Os autores estudaram o efeito da imersão em formol à 10% de casos levados ao processamento para IF com vistas a se estabelecer um tempo que o espécime pode permanecer em formol sem perder suas propriedades antigênicas e diagnósticas. Casos previamente conhecidos de dermatite herpetiforme (DE), pênfigo vulgar (PV), e Penfigóide Bolhoso (PB) foram expostos ao formol de 2 minutos a 2h. 

(1) A exposição mínima (2 minutos) já causa perda completa dos imunodepósitos necessários ao diagnóstico do pênfigo. (2) A exposiçãoo prolongada causa reação nuclear artefactual pode levar a diagnósticos errôneos de ANA in vivo do lúpus. (3) No intervalo intervalo intermediário de 10min a 2h a IFD de casos sabidamente diagnósticos de PB e DH retiveram níveis variados de ID detectáveis. 

O trabalho apresenta limitações devido ao baixo número de casos estudados (24 biópsias) bem como à baixa variedade de entidades que entraram no estudo (PB, PV e DH) e também por imergir em formol 10% espécimes previamente armazenados em MM, o que não reconstitui fielmente o erro de prática em questão. 

Na figura acima observa-se aos alterações determinadas pelo formol em um caso de pênfigo. Em (A) nota-se o padrão diagnóstico com positividade de membrana na epiderme. Em (B) e (C) nota-se artefato: marcação inespecífica do citoplasma, que foi observada em todos os tempo de imersão da biópsia em formol e que prejudica a detecção de depósitos intercelulares. Em (D) há o artefato de marcação nuclear que pode induzir a erro de interpretação (fator anti-nuclear in vivo do LES). 

Na DH (fotos acima) os ID de IgA granular na derme papilar foram mais resistentes à imersão no formol, no entanto observa-se queda da positividade a partir de 10 min de imersão (D). Aspecto semelhante foi detectado nos depósitos lineares de C3 do PB (preservação até 10 min, com queda do sinal proporcional ao tempo de imersão além da ocorrência de artefatos: fluorescência citoplasmática e depois nuclear). 

Espécimes destiados à IFD mostram graus variados de perda da fluorescência específica quando inadvertidamente imersos em formol. Tal perda é variável no tempo e conforme a doença em questão, sendo a fluorescência para o pênfigo a mais sensível. A epiderme do paciente com pênfigo é mais vulnerável à ação do formol enquanto que na DH e no PB a epiderme ainda protege de certa forma os ID. 

A ocorrência de um espécime ser inadvertidamente imerso em formol, ainda que por poucos minutos, deve imperativamente ser informada ao patologista dado que os artefatos pode induzir a erros de interpretação dos achados. 

Alguns trabalhos mostraram resultados divergentes, com preservação dos ID detectáveis à IFD:

1- Mera SL, Young EW, Bradfield JW. Direct immunofluorescence of skin using formalin-fixed paraffin-embedded sections. J Clin Pathol 1980; 33:365-9.

2- Firth NA, Rich AM, Radden BG, Reade PC. Direct immunofluorescence of oral mucosal biopsies: a comparison of fresh-frozen tissue and formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Oral Pathol Med 1992; 21:358-63.

Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline.

Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline.  
Robert M Vodegel et al. 
BMC Dermatol. 2004; 4: 10.

Os autores inadvertidamente deixaram uma biópsia em solução salina durante à noite e perceberam uma melhora na relação sinal-fundo (signal-to-noise ratio) na reação de imunofluorescência direta (IFD) em um caso de dermatose bolhosa. A IFD, a rigor, deve ser mantida em solução salina resfriada apenas em casos em que o transporte se fará rapidamente ao laboratório de plantão para receber as amostras (questões de horas). Diante da inesperada melhora no padrão da reação conseguida com esse descuido, os autores realizaram o trabalho testando a alocação de biópsias perilesionais de lesões bolhosas em solução salina (SS) por 24h e 48h, Meio de Michel (MM) por 24h e 48h e o congelamento imediato em nitrogênio líquido. A SS por 24h foi a que apresentou a maior sensibilidade na detecção de imunodepósitos nas dermatoses bolhosas testadas e os autores recomendam a prévia incubação overnight nesse tempo antes mesmo da fixação com o MM ou o congelamento.

Vinte e cinco pacientes sabidamente portadores de doenças que cursam com imunodepósitos (ID) detectáveis à IFD foram estudados, a biopsia prévia para estudo da IFD fora imediatamente congelada em nitrogênio líquido para corte-congelação. Quatro novas biópsias da área peri-leisional foram feitas e depositadas em meios de transporte diferentes: (a) nitrogênio líquido; (b) Meio de Michel por 48h; (c) solução salina por 24h; (d) solução salina por 48h.

Como resultado os pesquisadores perceberam que o (a) material transportado em solução salina foi tecnicamente mais simples de ser cortado ao criostato se comparado ao material transportado em meio de Michel. (b) As biopsias mantidas em solução salina por 24h mostraram menor fluorescência inespecífica da derme, principalmente com relação ao IgG. Aquelas mantidas por 48h mostraram perda do sinal tanto inespecífico quanto o específico e tenderam a negativar aquelas com baixo-sinal. Aquelas que possuíam sinal alto de positividade (+++/3+) mantiveram-se positivas em todos os meios/tempos de permanência. (c) Houve tendência à formação de clivagem artificial (split) no material mantido em salina, principalmente naqueles com 48h. Outras alterações relacionadas à autólise não foram identificadas. O Split artificial foi inclusive proveitoso tanto para o diagnóstico diferencial entre Penfigóide Bolhoso e Epidermólise Bolhosa Adquirida quanto para aumento do sinal da reação uma vez que a bolha formada artificialmente promoveu um fundo escuro. (d) Um caso de Penfigóide de Membrana Mucosa, originalmente fraco para IgG (+) e IgA (+) ficou óbvio na solução salina (tanto 24h quanto 48h) e resultou negativo nos outros meios de transporte.

Diante desses dados os autores concluíram que o transporte em solução salina por 24h é o que mais apresentou positividade para imunodiagnóstico em dermatopatias bolhosas se comparado ao congelamento imediato e à fixação no Meio de Michel. Esses resultados são corroborados por outros autores como Judd e Lever (1) que mostraram o efeito positivo de aumento da sensibilidade da IFD com o armazenamento em solução salina (24h em solução salina 1.5M + tampão fosfato) antes do congelamento. Atribu-se à melhor percepção dos anticorpos por um melhor contraste, uma vez que a diminuição do background realça os ID específicos. Há quem também atribua tal aumento da sensibilidade a uma maior exposição dos epitopos antigênicos. 

Uma desvantagem da solução salina é (a) seu tempo limitado de armazenamento (até 24h) para se conseguir resultados favoráveis. (b) A segunda desvantagem é devido a uma perda parcial de alguns ANA epidérmicos, possivelmente devido à extraçãoo ou degradaçãoo de alguns antígenos nucleares. (3) Há desvantagem também do ponto de vista da preservação das estruturas à histologia dada às alterações de degeneração hidrópica e clivagem da JDE, fenômens que não ocorrem com o transporte no meio de Michel. Por isso não se prescreve salina no caso de estudos de mapeamento de doenças genéticas e para microscopia eletrônica. Para o estudo de dermatoses bolhosas não é a morfologia ideal que conta, mas o sucesso em se detectar baixos limiares de ID, por isso o uso de SS24h é recomendado pelos autores nesses casos. A Solução Salina pode ser usada como meio padrão, em temperatura ambiente, em casos de transporte postal de biópsias para estudo de IF, se a entrega ao laboratório é garantida em até 24 horas. Outra alternativa é manter a biópsia em SS por 24h e depois fixá-la em meio de Michel para transporte. Caso a biópsia chegue imediatamente depois da coleta ao laboratório, os autores recomendam a incubação overnight em SS antes do congelamento para os cortes, para redução da auto-fluorescência dérmica e otimização dos resultados. 

Artigos citados: Judd KP, Lever WF: Correlation of antibodies in skin and serum with disease severity in pemphigus. Arch Dermatol 1979, 115:428-432.

Modelo de Laudo (Biópsia Renal)